2018年1月，当两个萌萌的体细胞克隆猴宝宝“中中”和“华华”第一次在公众面前亮相时，科研人员就曾预言，中国将率先建立起可有效模拟人类疾病的克隆猴模型，其既能满足脑疾病和脑高级认知功能研究的迫切需要，又可广泛应用于新药研发。
　　仅仅在一年之后，这个预言便成为了现实。


　　1月22日，在中科院神经科学研究所非人灵长类研究平台保育室，工作人员在给生物节律紊乱体细胞克隆猴喂食。新华社记者 金立旺 摄
　　1月23日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心研究团队对外宣布，通过体细胞克隆技术，成功获得了五只BMAL1基因敲除的克隆猴。这是国际上首次成功构建一批遗传背景一致的生物节律紊乱猕猴模型，意味着克隆基因编辑猴技术由此从理论层面迈向了实践层面，中国正式开启了批量化、标准化创建疾病克隆猴模型的新时代。
　　该成果于北京时间1月24日在线发表于中国顶级英文期刊《国家科学评论》。




　　非灵长类动物与人类高度相似，是研究节律紊乱相关疾病的理想动物模型
　　雄鸡报晓、蜘蛛半夜结网，向日葵在清晨开放……自然界中所有生物大都拥有按时间节奏调节自身活动的本领，我们称之为生物节律，也就是通常所说的生物钟。
　　研究表明，生物节律系统在维持机体内在的生理功能，如睡眠、体温、代谢和器官功能等，以及适应环境的变化方面扮演着重要角色。生物节律紊乱与睡眠障碍、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）、精神类疾病（如抑郁症）、糖尿病、肿瘤、以及心血管等疾病密切相关。
　　传统模式的小鼠和果蝇等动物模型因其与人的昼夜活动周期、脑结构和代谢速率等存在明显差异，极大地制约了生物节律紊乱机理研究和相关疾病治疗手段的研发。因此，亟需建立更为理想的动物模型。
　　中国科学院神经科学研究所所长、脑科学与智能技术卓越创新中心蒲慕明院士说：“非人灵长类动物在结构和功能活动等很多方面都与人类高度相似，是研究节律紊乱相关疾病机理和诊治手段比较理想的动物模型。”
　　然而，一直以来对非人灵长类动物的基因编辑非常困难，直到新一代基因编辑技术CRISPR/Cas9发明。
　　2015年底，研究团队尝试利用CRISPR/Cas9技术，敲除了猴胚胎中的生物节律核心基因BMAL1，产生了一批生物节律核心基因BMAL1缺失的猕猴。
　　“在哺乳动物的大脑中，有一个控制生物节律的‘起搏器’，他就是位于下丘脑的视交叉上核。如果将他损毁，动物的昼夜节律就会完全消失。”研究团队成员、神经科学研究所生物节律与衰老疾病研究组组长张洪钧研究员说，“这个起搏器平常一般是通过一系列节律基因来调控昼夜节律的，BMAL1便是这些核心节律基因中的一个。”
　　那么，这些被敲除掉BMAL1基因的猕猴是否会表现出节律紊乱的症状呢？
　　等到半年后小猴们断奶，研究人员开始从多个方面进行观察。结果，他们发现敲除猴不再按照24小时的周期活动，在夜间活动明显增多。此外，这些敲除猴的大多数节律基因表达异常，还有很多与睡眠剥夺，抑郁症以及衰老等相关的基因上调。
　　张洪钧说：“我们可以明显看出敲除猴表现出怕人。比如，当保育员靠近时，它会双手抱住头部，蜷缩在角落里，不敢活动。这些症状是以前在小鼠身上很难观察到的。”
　　基于此，研究团队最终确定，成功构建了世界首批核心节律基因BMAL1敲除食蟹猴模型。


　　五只生物节律紊乱体细胞克隆猴（2018年11月27日摄）。新华社发（中科院神经科学研究院供图）


　　利用基因编辑的细胞进行核移植是批量制备基因修饰猴模型的首选方法
　　核心节律基因BMAL1敲除食蟹猴模型的成功构建，为模拟人的节律紊乱相关疾病迈出了关键的一步。但是，它还并不能作为理想的动物模型。
　　张洪钧说：“通过基因敲除方法获得的第一代模型猴个体间存在遗传背景和基因编辑嵌合率差异，也就是其中有个体的BMAL1并未被完全敲除，所以表现出的生物节律紊乱症状的严重程度不一致。”
　　如何解决这个问题呢？
　　“个体差异大，对实验干扰就会比较大。”蒲慕明认为理想的基因修饰猴模型应该是背景相同且无嵌合，而利用基因编辑的细胞进行核移植是批量制备基因修饰猴模型的首选方法。
　　为此，研究团队在此基础上，采集了一只BMAL1基因敲除彻底，且睡眠紊乱症状最明显的猕猴的体细胞，通过之前掌握的体细胞克隆技术，成功获得了五只BMAL1基因敲除的克隆猴。
　　之后，为了确认是否克隆成功，研究人员仔细检测了这些克隆猴的细胞核基因型和线粒体基因型。
　　研究团队成员、神经科学研究所非灵长类研究平台主任孙强研究员说：“经过检测，这五只小猴的细胞核基因型与核供体细胞完全一致，而线粒体基因型则与卵供体猴一模一样，同时它们的所有基因与生出它们的代孕妈妈则彻底无关，完全符合克隆动物的鉴定金标准。”
　　值得一提的是，去年克隆“中中”和“华华”所使用的体细胞来自流产猴胚胎，而这次采用的是成年活体基因编辑猴的体细胞。
　　“克隆的成功率与作为核供体的细胞有很大的关系。”研究团队成员、神经科学研究所灵长类生殖工程研究组组长刘真研究员说，通常，细胞和人一样会在生长繁殖的过程中逐渐衰老，随着细胞不断分裂，会积累越来越多的DNA突变，细胞核的质量也会逐渐下降。所以，越年长的猴子，其体细胞活力就越弱，克隆难度就增大，成功率也可能随之降低。
　　但令科研人员没想到的是，当他们在对这个经过编辑携带疾病基因的成年活体猕猴体细胞进行细胞核移植时，发现比想象中的效率要高。
　　刘真说：“但这个现象是发生在特定细胞条件下，数量又少，是不是一个普遍规律还有待进一步研究。”


　　1月23日，在上海松江G60脑智科创基地举行的新闻发布会上，中科院神经科学研究所所长蒲慕明院士、张洪钧研究员、孙强研究员、刘真研究员（从左至右）在回答记者提问。新华社记者金立旺摄


　　将为人类重大脑疾病的机理研究、早期诊断、以及药物研发带来了前所未有的光明前景
　　相较去年“中中”和“华华”的克隆成功，此次利用体细胞克隆技术制作脑疾病模型猴意义更为重大，意味着克隆基因编辑猴技术由此从理论层面迈向了实践层面。
　　孙强说：“‘中中’和‘华华’本质上都还属于未经过基因编辑的野生型猴子。而此次这五只BMAL1基因敲除的克隆猴是疾病模型猴，是真正意义上能够广泛被应用的新型高效的动物模型，将为人类社会面临的重大脑疾病的机理研究、早期诊断与干预、以及药物研发带来前所未有的光明前景。”
　　国际权威专家评价：“这项研究首次证实通过体细胞核移植技术可以克隆成年基因修饰猴。这为在短期内生产一批无嵌合体的基因修饰猴提供了一个完美的解决方案。这样的克隆猴模型对人类疾病研究有重要价值。”
　　蒲慕明认为，该成果还有助于缩短药物研发周期，提高药物研发成功率，解决脑疾病机理研究和药物研发中的“卡脖子”问题，必将极大地促进生命科学和医学的发展，有力推动我国新药创制与研发。
　　对于公众所高度关注的克隆、基因编辑等技术所涉及的伦理问题，蒲慕明明确表示，中科院做这项工作的目的，是为提高人类健康、研究脑科学基本问题服务的，而且严格遵守了国际各项相关协议和规则。
　　相反，这项工作还可能使一些伦理争议得到化解。
　　目前，全世界每年对猕猴的使用量高达10万只，主要被用于药物筛选实验。利用体细胞克隆猴技术，人们就能使用体细胞在体外有效地做基因编辑，准确地筛选基因型相同的体细胞，产生基因型完全相同的大批胚胎，用母猴载体怀孕出生一批基因编辑和遗传背景相同的猴群。
　　蒲慕明说：“体细胞克隆猴技术让人们在一年内就能制备大批遗传背景相同的模型猴，大大减少了个体差异对实验的干扰。这样，只要使用很少数量的克隆猴，就能够完成很有效的筛选。这次获取的五只生物节律紊乱体细胞克隆猴模型，就是非常成功的实践。”
　　蒲慕明也同时表示，鉴于目前克隆技术是制造遗传背景一致的基因编辑猴的成本最低、耗时最少的手段，而作为全球暂时唯一掌握克隆技术的中科院神经科学研究所，有望在未来的神经科学研究中抢先一步。








　　【编辑：朱曦东】